Faire une préparation microscopique

 

 

 

 

Une préparation microscopique est constituée de :

  1. une lame de verre

  2. un objet de petite taille et de faible épaisseur

  3. une lamelle

L'objet, compris entre la lame et la lamelle, est traversé par la lumière et peut être observé au microscope.

 

Que peut-on observer au microscope ?

 

Les rayons lumineux chauffent la préparation légèrement mais ne sont pas destructeurs : on peut donc observer de petits êtres vivants entiers (bactéries, unicellulaires) ou des fragments vivants de plus grands organismes (végétaux ou animaux). On peut aussi observer les minéraux.

 

Les organismes unicellulaires au microscope 

Lorsque l’on place de l’herbe, du cresson, des grains de blé ou d’autres végétaux dans de l’eau, on observe quelques semaines plus tard une sorte de voile à la surface de l’eau : il contient des micro-organismes appelés paramécies.

Des colorants doivent être utilisés pour observer les bactéries du yaourt ou des levures (on met de la levure de boulanger dans de l’eau et on laisse les levures se réhydrater).

 

Le monde végétal au microscope 

  1. Les moisissures sont faciles à observer. Pour se procurer des moisissures, c’est très simple : On peut imprégner d’eau une tranche de pain que l’on dépose sur une assiette et que l’on recouvre d’un verre ou d’un saladier. Autant que possible, le verre choisi ne doit pas toucher le pain et doit reposer sur les bords de l’assiette. Au bout de quelques jours, on voit le pain se couvrir d’une multitude de moisissures de toutes les couleurs. On peut mettre sous le verre ou le saladier d’autres substances humides : du crottin de cheval, de la bouse de vache, des fruits, des haricots ayant gonflé dans de l’eau durant 24 heures, du bois, etc. 

  2. L’étude du pollen est également simple. Il suffit de prendre une étamine encore chargée de pollen dans une fleur. 

    Si on veut observer l’organisation d’un grain de pollen, on doit l’observer à sec : placés dans une goutte d’eau, les grains de pollen se gonflent énormément et les détails de la surface disparaissent. Les grains de pollen peuvent même éclater. Si on dépose le pollen dans de l’eau sucrée, on peut voir les grains se gonfler lentement et, quelques heures après, donner naissance à un tube qui s’allonge de plus en plus : c’est la germination du grain de pollen. 

  3. Sur l’écorce des arbres, on voit souvent une poudre verte : ce sont des algues microscopiques. On peut récupérer d’autres algues microscopiques en passant le doit sur la vitre d’un aquarium, là où on voit des taches vertes.

  4. Parmi les fragments de végétaux couramment observés, il y a l’oignon (au-dessous des « pelures » extérieures, l’oignon est constitué de lames épaisses imbriquées ; il faut prélever un fragment dans la pellicule extérieure de l’une ce ces lames).

Le monde animal au microscope 


  1. Les ailes des papillons sont recouvertes d’une fine poussière qui s’enlève facilement. Vue au microscope, cette matière pulvérulente se montre constituée par de petites écailles qui portent des dessins, des lignes très fines… On trouve aussi des écailles sur les ailes ou le corps de divers insectes. 


  2. En grattant la peau d’un poisson, on récupère aisément des écailles transparentes, que l’on peut facilement observer au microscope. 

  3. On peut observer des cheveux, des poils d’animaux ou de la laine. 


  4. Si on laisse un seau d’eau dans un jardin, au bout d’un certain temps, on pourra observer des sortes de petits vers noirâtres près de la surface, la tête en bas : ce sont des larves de moustique. 

  5. Pour observer des animaux singuliers, intermédiaires entre des vers et des acariens, on peut percer un point noir du nez : dans la masse blanchâtre qui sort vit un animal qui s’appelle Demodex folliculorum

    au microscope optique... et pour ceux qui aiment les photographies impressionnantes, une page en italien montre cet animal au microscope électronique à balayage.

  6. L’observation d’une goutte de sang exige qu’on se pique avec une aiguille à coudre que l’on stérilise en chauffant… 

  7. On peut aussi observer la circulation du sang chez un animal à sang froid tel qu’un guppy femelle : on sort le poisson de son aquarium, on lui met une gaze humide sur la tête et les branchies, et on place la queue bien étalée du poisson sous l’objectif du microscope… Dès que l’observation est finie, le guppy est libéré dans son aquarium. On peut aussi faire cette observation sur une patte de grenouille, au niveau des membranes qui relient ses doigts ; la circulation dans la langue de la grenouille serait encore plus belle… mais attention, la plupart des espèces de grenouilles sont protégées, il est interdit de les sortir de leur milieu ! 

Les minéraux au microscope 

Pour observer de petits cristaux au microscope, il suffit de dissoudre dans de l’eau du sel, du suce, de la vanilline… Il faut avoir une solution très concentrée. On dispose une goutte de la solution sur la lame de verre et on laisse la lame pendant plusieurs jours. L’eau de la goutte se concentre de plus en plus, et le sel cristallise sur la lame de verre.

 

Réaliser une préparation microscopique simple

 

Préparer le matériel

Rassembler une lame et une lamelle de verre propres et sèches, un compte-gouttes, un liquide de préparation (eau, colorée ou non), des pinces fines… et ce que l’on veut observer.

Placer l’objet sur la lame de verre

Si l’élément observé est liquide, on en prélève avec le compte-goutte et on en dépose une goutte au centre de la lame.

Si l’élément observé est solide, on dépose une goutte du liquide de préparation au centre de la lame, on place ensuite l’objet dans la goutte, à l’aide des pinces fines. Par exemple on prélève une petite partie de la moisissure que l’on veut étudier, en faisant le possible pour ne pas enchevêtrer les filaments.

Des éléments du type « poudre » se font à sec, sans eau ni colorant. C’est le cas des écailles des ailes de papillons (on enlève un peu de « poussière » d’une aile de papillon, on la dépose sur une lame de verre) ou du pollen (on frotte l’étamine sur le centre de la plaque de verre).

Pour observer de petits animaux, on utilise des lames spéciales qui ont un creux pour que l’animal puisse « tenir en épaisseur ». Ces lames sont appelées « lames à concavité ».

Recouvrir d’une lamelle

On prend la lamelle très délicatement par deux de ses cotés, on la pose contre la lame par un troisième coté. On approche la lamelle au contact du liquide, tout en la maintenant oblique par rapport à la lame. On lâche délicatement la lame.

 

 

Conseils pour réussir :

  1. Ne pas mettre trop d'eau sur la préparation, ne pas mouiller la platine et l'objectif.

  2. Regarder à l'oeil nu avant de mettre une préparation sous le microscope, on apprécie ainsi la taille de l'objet, sa couleur, son mouvement éventuel...

  3. Pour les moisissures : les filaments qui constituent les moisissures ne se mouillent pas facilement. Il en résulte qu’entre eux subsistent des bulles d’air qui gênent une peu les observations. Pour les diminuer, on peut remplacer l’eau par de l’acide lactique.

 

Les colorants pour préparation microscopique

 

La plupart des objets biologiques ne sont pas colorés ou sont faiblement colorés. D'où la nécessité de colorer la plupart des échantillons. Voici les principaux colorants, il en existe d’autres. 

 

Coloration des structures cellulaires

 

Bleu de méthylène

Dissoudre 1 g de bleu de méthylène dans 1 litre d’eau distillée, bien mélanger

Ce colorant est utilisé essentiellement pour colorer les noyaux et autres structures oxydantes

Bleu de méthylène phéniqué 

Dissoudre 2 g de Bleu de méthylène et 20 g de phénol dans 100 ml d’alcool à 95 %

Ce colorant est utilisé en bactériologie (coloration simple pour bactéries).

Liquide de Lugol 

Broyer dans un mortier 1 g d’Iode bisublimé et 2 g d’Iodure de Potassium 

Dissoudre dans 100 ml d’eau distillée 

(ajouter éventuellement un peu d’iodure pour permettre la dissolution totale de l’iode, conserver dans une bouteille en verre brun, s’utilise dilué et se décolore à la longue)

Ce colorant s'utilise comme colorant des noyaux des cellules végétales et des membranes.

Il permet la mise en évidence des grains d’amidon (amyloplastes) contenus dans les cellules végétales : par exemple dans le tubercule de pomme de terre, dans les grains de blé…

La coloration de Gram.

 

Mise au point en 1884 par le bactériologiste danois Hans Christian Gram, la méthode (ou coloration) de gram ne permet pas seulement de déterminer la dimension, la forme ou l'arrangement des bactéries, mais divise aussi les bactéries en deux grandes catégories selon leur coloration : 

  • les bactéries qui se colorent en violet sont dites « gram-positives »

  • les bactéries qui se colorent en rose sont dites « gram-négatives ».

C'est un important système de groupement parce que la couleur indique de quelle façon la cellule bactérienne est structurée et de quelle manière elle peut réagir à certains antibiotiques. Pour réaliser la coloration de Gram, on utilise plusieurs produits et, selon le type de paroi qui entoure les bactéries, c’est un produit ou un autre qui va être retenu. Résultat : les bactéries apparaissent de différentes couleurs. 

  • Les bactéries dites Gram positif, colorées en violet, ont une paroi très riche en peptidoglycane (polymère de glucides) qui retient le colorant violet, ainsi le rinçage à l'alcool ne parvient pas à éliminer la coloration au cristal violet.

  • Les bactéries dites Gram négatif, renferment très peu de peptoglycane dans leur paroi et apparaissent colorées en rose par la safranine, le rinçage à l'alcool éliminant la coloration au cristal violet. 

Technique opératoire : 

  • Faire un frottis de bactéries à identifier, laisser sécher à l’air libre. 

  • Fixer le frottis à la flamme et laisser refroidir. 

  • Recouvrir le frottis de cristal violet ; laisser 1 min puis rincer à l’eau distillée. 

  • Recouvrir la lame de Lugol (mordant) ; laisser 1 min puis rincer à l’eau distillée.

  • Recouvrir la lame d’Alcool (rinçage du cristal violet) ; laisser 30 s puis rincer à l’eau distillée. 

  • Recouvrir le frottis de safranine ; laisser 1 min puis rincer à l’eau distillée. 

  • Sécher et observer au microscope.

 

 

Coloration des chromosomes

 

Carmin acétique 

Dissoudre 0,5 g de Carmin 40 pour Histologie, dans un mélange de 55 ml d’eau distillée et 45 ml d’acide Acétique.

Porter le mélange à ébullition, laisser ensuite bouillir 1 à 2 minutes. Laisser refroidir, puis filtrer. Ce colorant se conserve bien à température ambiante.

Ce colorant s'utilise à chaud pour colorer les chromosomes des cellules de racines de liliacées

Il s’utilise à froid pour colorer les chromosomes des cellules des parois de glandes salivaires de chironomes (laisser agir quelques minutes).

Orcéine acétique 

Dissoudre 1 g d’Orcéine dans 45 ml d’acide Acétique.

Porter le mélange à ébullition, laisser bouillir 1 à 2 minutes.

Laisser refroidir et filtrer.

Ce colorant se conserve bien au frais (non dilué).

Ce colorant s’utilise dilué au demi pour la coloration à froid des chromosomes des cellules de racines de liliacées, après trempage dans un bain d'acide chlorhydrique.

Vert de méthyle acétique 

Dissoudre 1 g de Vert de Méthyle dans un mélange de 55 ml d’eau distillée et 45 ml d’acide Acétique.

Ce colorant s'utilise pour colorer les chromosomes des cellules des parois de glandes salivaires de chironomes.

 

Coloration des vacuoles végétales

 

Rouge neutre 

Dissoudre 1 g de Rouge Neutre dans 1 l d’eau à pH 7 (tampon phosphate ou eau de Volvic)

Colorant de la vacuole, le rouge neutre s'utilise sur toutes les cellules végétales (épithéliums, poils absorbants...)

 

Coloration des coupes de tissus végétaux

 

Carmin aluné 

Dissoudre 1 g de Carmin 40 pour histologie et 4 g d’alun de Potassium dans 100 ml d’eau distillée. 

Porter le mélange à ébullition, laisser refroidir et filtrer.

Colore en rose les tissus contenant de la cellulose (phloème ...)

Vert d'iode 

Dissoudre 1 g de vert d’iode dans 100 ml d’eau distillée.

Colore en vert les tissus lignifiés (xylème, sclérenchyme...)

Carmin Vert d'iode (ou Carmino-vert de Mirande) 

Dissoudre 6 g de Carmin 40 pour histologie et 12 g d’alun de Potassium dans 200 ml d’eau distillée. 

Chauffer à feu doux, ajouter 200 ml d’eau distillée et 0,4 g de Vert d’Iode, porter à ébullition puis laisser refroidir et filtrer.

Double coloration des tissus végétaux (colore en rose les tissus cellulosiques et en vert les tissus lignifiés)

Les colorants spécifiques

Rouge Soudan III

Dissoudre 1 g de Rouge Soudan dans 100 ml d’alcool à 70 %.

Laisser décanter puis filtrer.

Peu soluble dans l'alcool et très soluble dans les lipides, le rouge soudan III colore les lipides, par exemple les lipides du lait ou des graines à réserves lipidiques.

Bleu de Toluidine

Dissoudre 0,1 g de bleu de Toluidine dans 100 ml d’eau distillée tamponnée à pH 4,6 (tampon acétate).

Ce colorant est utilisé pour colorer les protides, par exemple les grains d'aleurone des graines à réserves protidiques ...

 

 

Pour en savoir plus : Ce qu’on peut voir avec un petit microscope par Henri Coupin. Même si ce livre date de 1934, il reste intéressant à lire car il décrit comment observer un grand nombre d’êtres vivants, et les planches dessinées aident à reconnaître les êtres vivants observés, qu’il s’agisse de moisissures, de grains de pollen, d’organismes microscopiques aquatiques…